替代方法开发技术

替代方法开发

如果等度分离或梯度聚焦都不能完全分离目标化合物，可以通过更改溶剂、pH值、固定相和/或温度重新开发分离方法。这类修改会对分离产生显著影响，因此进行以上任何更改之后都必须运行探索梯度并进行方法优化。

溶剂

HPLC流动相由三种组分组成：弱溶剂、强溶剂和改性剂。溶剂必须具有高纯度、可与检测器兼容、不与样品反应，并且粘度应较低，以保持低系统背压。

反相色谱通常以水作为弱溶剂，常用的强溶剂是乙腈和/或甲醇，因为它们粘度低、溶剂强度高，并且在短波长范围内兼容UV检测。此外，乙腈和甲醇还能提供理想峰形，分离之后易于通过蒸发去除，而且不与大多数样品反应。

和所有用于色谱分离的溶剂一样，分析样品时必须保持检测波长高于已知的溶剂UV截止波长值。若波长低于该值，检测器会将溶剂组分变化记录为基线漂移或其它色谱干扰。

表2：常用色谱溶剂及其UV截止波长

峰分离和出峰顺序会根据分离所用的强溶剂不同而改变。预测可使目标化合物达到最高分离度的溶液非常困难，因此，通常需要通过试错法来确定强溶剂。或者，也可以使用混合强溶剂（例如，50:50乙腈/甲醇）达到理想的洗脱顺序或分离度。

图9：乙腈和甲醇的洗脱顺序对比³

pH值

流动相pH值是控制反相分离保留性的一个非常重要的变量。化合物通常都含有一个或多个酸性或碱性官能团，因此大多数反相流动相的pH值都有必要加以控制。

当酸的pH高于或低于其pKa 2个以上pH单位时，99％以上的酸将分别处于电离或未电离状态。相反，碱在pH值低于其pKa时电离，在pH值高于pKa时为未电离状态。未电离物质的极性较小（更疏水），因而在反相体系中保留性更强。因此，酸在低pH值条件下保留性更好，而碱在高pH值条件下保留性更好⁴。

图10：流动相pH值对分析物保留性的影响。选择对应于保留图稳定区域的流动相pH值可实现十分稳定的分离。非电离形式的酸和碱保留性非常理想，而中性分析物的保留性不受pH值影响

如果流动相pH值接近目标化合物的pKa，则很小的pH值变化也会显著影响其保留性，从而直接影响分离稳定性。我们通过添加缓冲液来控制流动相pH值。加入少量酸或碱时，缓冲液可保持pH值不变。缓冲液在其pKa ±1个pH值单位范围内使用十分有效，不过有的缓冲液在其pKa ±2个pH值单位范围内也具有足够的缓冲能力。

图11：化合物选择性与pH值。酸性和碱性化合物的洗脱顺序因其电离情况不同而发生了显著变化，而中性化合物未受影响

在选择运行pH值时，还应考虑色谱柱稳定性。硅胶基色谱柱在pH 2至pH 8之间性能非常理想。键合相在低pH值下易水解，而在高pH值下，硅胶主链会变得易溶解。当pH值高于8时，需要使用非硅胶基质颗粒或具有专用键合相（在高pH值条件下稳定）的颗粒。pH值限值和通用处理建议可参阅色谱柱说明书或访问色谱柱制造商网站。

图12：基于沃特世表面带电杂化(CSH)硅胶基质的专用键合相示例及其建议pH值范围

当色谱方法用于纯化目的时，用于调节pH的缓冲液添加剂必须具有足够的挥发性，以便从纯化后的分离物中去除。此外，使用挥发性添加剂时，必须注意避免MS源被污染或产生沉淀。甲酸、乙酸和醋酸铵等常用添加剂以0.05%~0.1％的浓度溶解于流动相时性能非常理想。不建议在纯化或MS应用中使用液相色谱分离最常用的缓冲液添加剂 - 磷酸盐。

建议的缓冲液浓度为5~10 mM。如需使用缓冲液，应在制备完成后进行过滤，不使用时应冲洗泵管路，以避免在线沉淀，还需定期更换溶液以防止微生物生长积聚。

图13：流动相缓冲液选择指南，附MS兼容性

固定相

色谱柱固定相会显著影响分离。反相色谱使用C18到C8的固定相，某些固定相还含有专为提高选择性和分离能力而设计的键合相。许多实验室的色谱柱库存有限，因此更换固定相通常是调整溶剂和pH值均无法达到足够分离度时的最后选择。沃特世常见色谱柱选择卡(www.waters.com)可对比不同制造商色谱柱固定相的选择性。在方法开发的早期阶段，该工具非常适合用于比较色谱柱选择性。

图14：沃特世常见色谱柱选择卡，可通过www.waters.com/selectivitychart 上的Web Toolbox（网络工具箱）访问

柱长

色谱柱柱长也是影响分离性能的因素之一。市面上有多种色谱柱柱长可供选择，包括25 mm、50 mm、100 mm、150 mm和250 mm。较短的色谱柱塔板数较少，适用于快速分离，而较长的色谱柱塔板数较多，因此保留时间较长。随着柱长增加，柱压、运行时间、溶剂消耗量和成本也会相应地增加，因此能够达到足够分离度的尽可能短的色谱柱是十分理想的选择。

图15：不同柱长色谱柱的分离度对比。100 mm色谱柱改善了主峰与邻近杂质之间的分离度，总运行时间随柱长增加而延长³

粒径

样品流经填料时，色谱柱阻止样品谱带扩散或展宽的能力称为“柱效”。由于小颗粒内的峰扩散较低，小粒径色谱柱的柱效更高。高柱效可使峰宽更窄，赋予色谱柱更强的分离能力。

制备型色谱柱的粒径通常为5~10 μm，超高压分析型分离则使用粒径为1.7~3.5 μm的色谱柱。虽然极小的粒径可带来更高的柱效，但代价是色谱柱成本和系统背压增加。出于以上原因，以较高流速分离粗制样品混合物的大规模制备型色谱柱一般不会采用粒径非常小的颗粒。

图16：采用不同粒径色谱柱分离相同物质的色谱结果对比³

温度

由于不同的温度会影响色谱选择性，因此加热色谱柱是优化具体样品分离结果的一种非常方便的手段。流动相粘度和系统整体压力随温度升高而降低，进而降低系统、接头和色谱柱压力，最终有利于提高运行的稳定性。调节温度还可缩短保留时间并改变分离的选择性。峰分离度会随温度变化增大还是减小很难预测，因而温度对于每次具体分离有特定的影响。

尽管温度控制是小规模色谱的常规控制手段，但制备级纯化很少将温度作为操控色谱分离的参数。首先，大内径色谱柱难以从外部均匀加热。其次，大规模的高流速分离中通常会保持流入溶剂的温度。虽然电热毯和柱温箱可满足小规模分离的加热需求，却无法在直径方向上均匀加热大型色谱柱。因此，色谱柱直径方向上会形成温度梯度，对色谱分离产生不利影响。

若必须借助温度控制来保持样品溶解性，可在制备型色谱柱柱头处连接一段管路，并将其放置在加热的水浴中，以消除温度梯度。这一段管路被用作预加热器，将流入溶剂平衡至所需温度⁵。将来需要放大的色谱方法最好在室温条件下开发，尽量不使用温度控制手段。