合相色谱基本原理

CC基本原理

任何色谱分离的基本原理都是建立可达到如下目的的分析条件：使得样品混合物中的所有分析物分子都能通过分离系统，但移动速度各不相同，这样一来，当它们从分析柱上洗脱时，彼此之间能够充分分离，以便我们进行检测和定量。实现这样的分离过程依赖于色谱的两个主要组成部分：固定相和流动相。固定相的主要作用是阻止或保留化合物移动，而流动相的作用是携带化合物并迫使它们从系统入口移动至出口。这就是GC、LC和CC的基本原理。CC与LC或GC的主要区别在于流动相性质对相应的色谱行为造成的影响。

图2：分析实验室使用的三种互补色谱技术

CC流动相与LC和GC流动相的作用比较

GC流动相通常为惰性或非反应性气体，典型流动相包括He或N2。在GC操作温度和压力下，流动相无法溶解分析物分子或与固定相表面发生相互作用，其主要用作分析物分子通过气相色谱柱的载体或驱动力。分析物的保留和分离仅受分析物分子与固定相之间的相互作用影响。对应的图示解释参见图3，其中分析物分子周围是空白区域。

图3：气相色谱(GC)、反相液相色谱(RPLC)、正相液相色谱(NPLC)和合相色谱(CC)的原理示意图，根据流动相发挥的作用绘制。黄色和红色的大圆圈表示分析物分子。RPLC、NPLC和SFC图示中的小圆圈表示溶剂分子。每幅图示底部，附有小圆圈的一薄层障碍物表示固定相。

另一方面，在LC中，流动相发挥着积极作用，其中的分子会与分析物分子和固定相发生强烈的相互作用。流动相对分析物保留性的影响不仅体现在分析物会直接溶解于流动相中，还体现在流动相会与分析物竞争固定相表面，从而影响分析物与固定相之间的相互作用(图3)。

图3展示了RPLC和NPLC模式的LC分离。注意，这两种LC模式之间的主要区别之一在于流动相的组成，RPLC使用水性流动相，而NPLC使用有机流动相。在RPLC中，水性流动相会与C18固定相结合，能够有效改变分析物与固定相之间的相互作用，因此在分离多种混合物样品中的目标分析物时发挥着重要作用。在RPLC方法开发中，通常首先改变流动相而非固定相。相比之下，NPLC采用基于正己烷或庚烷的流动相，其发挥的作用相对较小，化合物分离在很大程度上依赖于改变固定相填料。

CC流动相的作用介于RPLC和NPLC之间，这是因为CO2(超临界状态或非超临界状态)具有独特的性质。和庚烷或正己烷一样，压缩CO2是非极性的。从这个角度来看，CC更接近NPLC。但它们之间有一个关键的区别，即CO2可与极性助溶剂(例如甲醇、乙醇、乙腈等)完全混合，因此，不同于几乎只能在等度模式下运行的NPLC，CC可采用梯度模式。此外，CC对流动相中存在的少量水的耐受程度高于NPLC，这在分析物洗脱中发挥着重要作用。

下一节将根据CC与RPLC和NPLC的主要溶剂之间的性质差别，对它们进行系统性的对比。

CO2性质对色谱行为的影响

CO2与其它溶剂的互溶性

CO2是一种非极性溶剂，其极性指数接近庚烷(=0.1)[2]。但与庚烷不同，CO2具有非零四极矩(-13·4 ± 0·4 × 10 -40 C m²)[3]，而且能与强极性有机溶剂(例如极性指数=5.8的乙腈和极性指数=5.1的甲醇)完全混溶。虽然它与水(极性指数=10.2)只能微量混溶，但能够与含水比例相当高的甲醇/水、异丙醇/水或乙腈/水混合物混溶[4]。这种广泛的混溶性使得CC流动相的极性能够扩展至比NPLC和RPLC流动相更宽的范围。表1简明地展示了RPLC、NPLC和CC所用溶剂的洗脱(洗脱强度)值和极性指数情况。

由表1可知，水性RPLC流动相只能使用洗脱序列中的部分溶剂，因为水与大部分其它有机溶剂的互溶性有限。类似地，由于非极性有机溶剂与强极性溶剂的互溶性有限，因此基于己烷/庚烷的NPLC流动相也只能使用有限洗脱范围内的溶剂。NPLC的另一个问题在于，并非所有有机溶剂都可以彼此混溶，因此某些混合物不兼容。而另一方面，CC采用的压缩CO2可与整个洗脱序列中的所有其它溶剂混溶，为我们改善分离选择性提供了宽泛的流动相选择范围(见表1)。尽管CO2是非极性的，但CC的洗脱能力与RPLC相当，因为其洗脱强度范围比NPLC更广(尤其是在洗脱强极性化合物方面)。例如，将CO2和甲醇结合，流动相洗脱强度可在0至0.73E°范围内进行调节。

表1：反相、正相和合相色谱所用溶剂的选择性(洗脱值和极性数据分别摘自参考文献[5]和[2])

CC使用的超临界CO2可与整个洗脱序列混溶，为开发分离方法提供了不同的溶剂选择性

表2：反相、正相以及合相色谱的固定相选择

合相色谱可使用传统正相和反相色谱柱填料，为开发分离方法提供了不同的选择性

除了洗脱范围极广之外，基于CO2的CC流动相还可兼容多种固定相填料。表2列出了NPLC和RPLC常用的固定相。大多数RPLC分离都使用C18固定相，在相对较少的情况下还会使用其它键合相。上表所列的某些固定相由于极性较高，不适用于RPLC。类似地，对于NPLC，色谱柱选择也受限于流动相极性范围。而对于CC，由于其极性范围更宽，因此表中的所有色谱柱固定相均适用 - 有效扩展了分析的选择性范围(见图4)。正如West和Lesellier所说的[6]，由于所有这些固定相都可采用相同的流动相组成，我们有望将极性完全不同的色谱柱配合使用，这一点令人振奋[6]。

图4：采用CC开发分析方法时，色谱柱选择性是极其强大的工具。本示例在一组固定的条件下，采用多种固定相(典型的反相和正相分离固定相)分析了一种药物活性成分及其相关化合物。

CO2互溶性之所以如此重要的另一个原因是它使得CC可兼容各种样品稀释剂(溶解或稀释样品的溶剂)。CC的这一特点对实验室的整体工作流程具有重要影响。样品制备往往是色谱实验室的最大瓶颈。大部分常用样品制备方法都会将目标分析物溶解在不兼容实验室现有LC系统的溶剂中。例如，许多分析物可轻松溶于有机溶剂，因此使用有机溶剂的提取效果非常好。由于RPLC不兼容有机溶剂含量高的样品，因此通常需借助额外的步骤将有机溶液或提取物转化为RPLC兼容的物质(图5)。CC允许直接进样溶解于有机溶剂中的样品，无需执行挥干有机溶剂并将样品复溶于水性稀释剂(相当耗时)这些反相分离中必须执行的步骤。从整体影响上来看，这不仅大幅节省了分析成本，分析时间也将大大缩短，对于采用多套RPLC系统分析大量样品的实验室而言效果尤为突出。

图5：几种样品制备技术示例，这些方法通常最后都会将样品溶于有机溶剂

CO2输送性质

CC的另一个性质优势在于CC流动相的低粘度使得其中的分析物分子具有高扩散性。从物理性质的角度来看，色谱柱柱效取决于分析物在流动相中的扩散性。分子的扩散性越高，其进出固定相颗粒孔隙的速度就越快，如此一来，即使流动相流速较快，也可达到高柱效。对于CC，即使加入大量液体改性剂(例如CO2/甲醇，70/30，mol/mol %)，流动相粘度也至多仅为LC流动相的一半(见表3)。这意味着CC可在明显更高的流动相流速下运行而不影响柱效。这使得CC成为了高通量分析的理想选择。图6所示为Van Deemter曲线，比较了CC与其它分离模式的色谱效率。

表3：所有数据均来自NIST-REFPROP7(除乙腈外)

图6：Van Deemter曲线，展示了HPLC到UPLC以及SFC到UPC2的演变。有趣的是，HPLC和SFC都获得了类似的优异效率。关键区别在于更高的线速度缩短了分析时间并获得了更出色的分离效率。

CC在两个重要应用领域的优势非常明显：快速手性筛查以及在非手性分离中用作正相色谱的替代技术。用于手性筛查时(图7)，CC可将分析时间从20 min缩短为仅仅3 min，时间缩短了7倍，分离度也得以改善。上述改善得益于CC中采用的溶剂梯度，而这在NPLC中是无法实现的。CC的另一个优势在于溶剂消耗量更少，因此大幅节省了成本。

图7：CC在使用UPC2进行快速手性筛查时的实用性

图8：以CC替换正相色谱的实用性

使用主要由压缩CO2组成的流动相替代正相有机溶剂，可将每个样品每次分析的成本从大约六美元降至仅五美分(图8)。分析时间缩短、溶剂购买和处置成本降低会对总体财务情况产生巨大影响。

其它优势性质的作用

表4列出了CC流动相相较于LC流动相的优势。除了互溶性强、粘度低之外，较低的表面张力也是CC流动相的优势之一。低表面张力使得流动相能够更快地进入固定相颗粒的孔隙，从而加快色谱柱平衡过程。

CO2的一些其它性质也让CC成为了很具吸引力的色谱系统，那就是操作成本更低、更安全且更环保。CO2易于获得，而且不依赖任何其它关键工艺(例如，乙腈是石化工业的副产物)。商品级CO2是碳中性的，是公认的绿色溶剂。CO2的成本远低于其它有机溶剂，而且可以直接排放到大气中(如果不回收利用)，不会产生任何处置成本。

CO2不可燃、无毒且易于储存。目前还没有其它任何流动相能像CO2一样集广泛互溶性、低粘度优势于一体，也没有任何流动相能在经济性和环保性方面与之比肩，这使得CC在许多应用中远远优于LC。表4集中列出了CO2作为一种独特溶剂的所有优势性质。

表4：CO2的有用性质

是否需要达到超临界状态？

如前文所述，从色谱分析的角度来看，流动相是否处于超临界状态对于CC而言并不重要。然而，进行色谱分离时，CC流动相必须是均一的，而不能是气体和液体的不均一混合物。为确保其均一性，CC中的流动相须保持在一定压力以上，这可以通过自动背压调节器(ABPR)进行轻松设置。