图H中，三个时间上分开的色谱峰代表三个染料化合物。每一个洗脱物在一个特定的位置，时间段计算从进样[零时]到峰最高点洗脱出来为止。比较每个峰的保留时间[tR]和注入同一色谱系统的标准物质[相同流动相和固定相]的保留时间，色谱工作者就可能鉴定每一个化合物。
图 I -1 中出示的色谱图，色谱学家已经知道，在设定的液相条件下，分析物丙烯酰胺可以被分离并在2.85分钟[保留时间]从柱中洗脱下来。当任何一个新样品含有丙烯酰胺时，在相同的液相条件下，都会在2.85分钟出现色谱峰[如图 I -2 种样品 B]。[欲进一步了解为什么有些化合物比另外一些移动得慢[更强保留]，请参考28页"高效液相色谱分离模式"]。当鉴定完成后，下一个重要的信息是样品中每一个化合物的含量是多少。来自检测器的色谱图和相应数据帮助我们计算每种化合物的浓度。检测器基本上反映化合物谱带通过流通池的浓度。浓度越高，信号越强，这可从基线上色谱峰高度观察到。
Figure I-2: Identification and Quantitation
图 I-2中，样品A和B的色谱图，在同一时间段相互重叠。两个样品的进样体积是一样的。两张色谱图在保留时间[tR] 2.85 分钟时都出现了一个色谱峰，表明每个样品都含有丙烯酰胺。然而，样品A显示出一个明显变大的丙烯酰胺峰。峰下面的面积[峰面积计算]是测量化合物浓度的一种方法。峰面积数值是由计算机数据站自动积分和计算。在这个例子中，样品A中丙烯酰胺的峰面积是样品 B 中的十倍。利用标准样品对比，可以推断样品 A 含有 10 pg 丙烯酰胺，是样品 B 中丙烯酰胺含量的十倍[1 pg]。注意另外一个峰[没有鉴定] 在两个样品中的洗脱时间都是 1.8 分钟。由于峰面积在两个样品中大致相同，因此这个未知化合物可能在两个样品中含量相同。
等度和梯度液相系统操作
高效液相色谱使用两种基本的洗脱模式。第一种称为等度洗脱。在这种模式下，流动相，无论是纯溶剂或混合物，在整个操作过程中保持不变。一个典型的系统如图J-1所示。
第二种称为梯度洗脱，正如名称所指，流动相的组成在分离过程中发生变化。这种模式对含有多种不同色谱极性化合物的样品非常有用[参见"高效液相色谱分离模式"]。随着分离的进行，流动相的洗脱强度逐渐增强以洗脱出更强保留的样品组分。
一个简单的例子，如图 J-2 所示，有两个溶剂瓶和两个泵。每个泵的流速由梯度控制器管理，在分离过程中传输或多或少的溶剂。两种溶剂在混合器中混匀形成实际流动相，再传输到色谱柱上。起始阶段，流动相含有大比例的弱溶剂[溶剂 A]。一段时间以后，强溶剂[溶剂 B]的比例增加。注意图 J-2中，混合器是两个泵的下游，因此，梯度是在高压下产生的。另一种高效液相色谱系统可设计为在泵前低压条件下混合多种溶剂。一个梯度比例阀从四个溶剂瓶之间选择溶剂，随时间改变流动相强度[如图 J -3]。
高效液相色谱量级 [分析，制备和工程]
我们已经讨论了高效液相色谱如何提供分析数据，用于定性和定量样品中的化合物。然而，高效液相色谱也可以用来纯化和收集所需的每一个化合物，在流通池下游使用组分收集器。这个过程被称为制备液相[如图 K].
在制备液相中，科学家可以收集每个流出色谱柱的组分[例如：在本例中，黄色，之后红色，之后蓝色]。图 K: 高效液相色谱系统用于纯化：制备色谱法馏分收集器在特定的时间段，选择收集纯化了的组分。收集瓶可移动，从而使每瓶只收集单个峰的组分。科学家确定纯化的程度和数量的目标。结合样品的复杂性，所需组分相对基质的性质和相浓度等考虑，这些目标，又决定了需要处理的样品量和高效液相色谱系统的处理量。总的来说，随着样品量的增加，高效液相色谱柱尺寸将会加大，泵也会需要更高的体积流速。决定一个高效液相色谱系统的处理量称为选择高效液相色谱的量级。 表 A 列出各种高效液相色谱的量级及其色谱分离目标。
通过特定地匹配HPLC的固定相和流动相来尽可能增大选择性-即获得两组分的最大分离度-在决定一个分离过程所需时很关键[参考"讨论高效液相色谱分离模式"]。容量成为衡量匹配上样量的柱体积[Vc]和选择适当颗粒[决定压力和效率，参考分离能力的讨论]的关键。柱体积，填料床长度[L]和内径[i.d.]，决定填料多少。(如图 L).
Figure L: HPLC Column Dimensions
总的来说，高效液相色谱柱长度[L]在 20 毫米到500 毫米之间，内径[i.d.]在 1 毫米到100 毫米之间。随着色谱量级的增加，柱尺寸增加，横截面积增加。为了优化通量，流动相流速必须与横截面积成比例增加。如果较小的颗粒要获得更强分离能力，泵必须设计成能承受更高反压下的更高流动相体积、流速。表 B 列出一些简单的挑选准则，为每种色谱量级推荐的色谱柱直径和颗粒尺寸范围。
例如，半制备级液相[红色 X]可以用内径10 -40 毫米装 5 -15 微米的颗粒。柱长度可根据需要纯化的化合物的量和要求分离的程度计算出来。当你放大分离处理量时，沃特世制备计算器软件 CD 可以帮你恰当地选择色谱柱和设定其他操作参数，如流速。 请浏览 <https://www.waters.com/prepcalc>。
