纯化产物分离
开发分离方法并放大至所需规模后，最后一步是分离或收集目标化合物。馏分可在系统监测到峰洗脱时由操作人员手动收集，也可由系统根据检测器信号或保留时间自动收集。
图41：纯化产物分离工作流程。
馏分延迟时间
当检测器检测到符合用户定义的收集触发条件的峰时，会执行馏分收集。检测器检出峰时，馏分还没有到达馏分收集器。如果馏分收集器被过早触发，将收集不到该峰对应的馏分。为了精准触发馏分收集，必须事先确定特定于系统的馏分延迟时间。其中一种校准方法是执行浓缩染料进样，然后比较检测器检出染料的时间与染料到达馏分收集器的时间。馏分延迟时间校准通常只需进行一次，在软件中输入该参数后，系统将为所有流速重新计算延迟时间。如果对检测器到馏分收集器之间的流路进行了调整（如添加了分流器），必须重新校准馏分延迟时间。
图42：造成馏分延迟时间的系统流路区段（以虚线圈出）。
手动馏分收集
手动收集非常简单易行。用户通过在线仪器软件的实时信号图监测到化合物洗脱时，触发馏分收集器上分流阀的开关。由于只收集纯化运行中用户需要的馏分，手动馏分收集具有更高灵活性，但因其缺乏自动化，通量较低。
基于峰的馏分收集
基于峰的触发是一种根据检测器信号收集馏分的自动收集方式。决定色谱图中的峰是否会触发馏分收集器的参数通常包括峰高、阈值和/或斜率。
基于峰的馏分收集最常用的方法是由峰高或阈值来触发收集。信号一旦达到设定的检测器高度，就会触发馏分收集，当信号降至设定高度以下时，停止收集。
由斜率触发的馏分收集方法通常难度更大，但可以用于收集未实现基线分离的峰。根据斜率进行收集时，软件沿色谱图的一阶导数检测数学拐点，检测到拐点时自动触发馏分收集。
图43：基于峰的馏分收集。
由质谱检测触发的馏分收集在基于质量数的馏分收集中，系统只收集具有用户设定的质量数的化合物。因此，基于质量数的收集比基于峰的收集更高效。基于质量数的馏分收集要求如下：
- 化合物的分子量必须已知。
- 化合物必须可电离，以便执行质谱检测。
图44：基于质量数的馏分收集。
馏分分析
收集馏分之后，可以在收集容器中直接分析馏分，也可以去除溶剂得到纯产物。可使用旋转蒸发仪来干燥馏分，利用该工具蒸发掉样品中的溶剂，然后对样品中的水性部分进行冷冻干燥。如果使用的是无机缓冲液，或者如果水性部分所占比例特别大，可使馏分通过反相SPE小柱以捕集目标化合物（即所谓的“脱盐”），然后用少量更易蒸发的有机溶剂将其洗脱¹。
图45：旋转蒸发仪的构造。
通过使用多种常规分析技术（例如UV、IR、MS、NMR、X射线分析和/或结构解析）进行馏分分析可估计回收率。如果有可用的标准品，可以直接对比分离物数据与文献数据，但如果目标化合物未知，则需要建立一套全面、系统的分析方案，运用多种物理、化学和光谱技术来确定化合物纯度和稳定性。
公式14：回收率(%)
分析分离物时，如果未达到预期的纯度、回收率或活性，请从以下方面检查分离物：
- 如果直接检测收集容器中的分离物，收集容器中可能会形成浓度梯度。因此，纯度分
析结果受收集容器中采样位置的影响。分析前应充分混合样品，以便获得具有代表性
的结果。
- 如果样品易溶于强溶剂（如DMSO）而不溶于流动相，储存在收集容器中的馏分将随
着时间推移结晶。在这种情况下，从液相中采样进行纯度和浓度分析所得的结果只能
代表可溶部分。
- 由于馏分收集、纯度检测以及活性检测之间存在时间间隔，活性化合物可能因降解而
损失。此外，干燥过程也可能导致活性化合物降解。因此，一般干燥之前和之后都要
进行活性检测。
- 活性化合物仍保留在色谱柱上（未成功洗脱）。
- 活性化合物在分离所用的条件下不稳定。
- 提取溶液所用的溶剂可能与流动相不相容，导致产生了沉淀。
- 大部分活性化合物分散在多种馏分中，导致馏分中的化合物量过低，无法检出。
- 提取物的活性还依赖于粗制样品中的其它化合物，目标活性化合物并不是单独有效的¹。
- 如果在邻近洗脱杂质无UV吸收能力的波长下收集馏分，分离物纯度可能达不到预期。
如果分离物不满足应用的纯度、通量或回收率要求，可以使用相同分离方法，或者使用不同选择性的色谱柱开发新的总体分离方法对分离物进行再纯化。为了达到纯化的纯度、通量和回收率目标具体需要投入多少时间和精力，取决于色谱工作者自己。
