使用合相色谱进行方法开发

 CC方法开发

本章首先回顾合相色谱的相关术语，然后介绍适合采用ACQUITY UPC2系统进行分析的样品和分析物类型。我们将阐述助溶剂、流动相添加剂和样品稀释剂的作用，以及压力和温度对流动相密度的影响，还将介绍上述效应如何影响分离。最后会介绍用于方法开发的通用方案。

术语

如前文所述，CC与RPLC类似，但CC以压缩CO2而非水作为弱溶剂(流动相A)。溶剂、助溶剂和改性剂等传统术语都是指流动相B的主要液体组分，即强洗脱溶剂。通常情况下，CC中的助溶剂是甲醇，但也可使用其它有机溶剂，如乙醇、异丙醇、乙腈或者这几种溶剂的组合。添加剂是添加到助溶剂中的低浓度盐或液体，其作用是改善峰形和/或分析物的溶解性。添加剂还可影响色谱选择性。常用的添加剂包括二乙胺、氢氧化铵、甲酸、三氟乙酸、甲酸铵、醋酸铵或少量水。适用的浓度取决于所用的添加剂，例如，如果其它方法条件选择不当，添加5%以上的水可能会形成双相流动相。

图25：一种碱性化合物及其部分有用的理化性质

图26：分配系数P的测定公式

面对新的分析方法，人们首先会问：“我的样品适合采用这种技术(合相色谱)分析吗？”非常简单的答案是：只要样品能溶于有机溶剂，就可以用CC分析。这个问题没有统一的答案，需要通过实验来确认。鉴于许多样品制备技术都会得到溶于有机溶剂中的样品(例如液/液萃取、固相萃取、蛋白质沉淀)，CC对有机进样溶剂的兼容性为分析人员带来了极大便利。CC的优点在于，这些溶于有机溶剂的样品可直接进样到ACQUITY UPC2系统中，省去了通常在RPLC分析中必须执行而且费时费力的挥干和复溶步骤。第5章将详细介绍这一主题的内容。对分析科学家来说，尽可能多地了解样品十分有用(图25)，掌握的信息越多，开发出稳定方法的几率就越高。分配系数P(通常被称为log10 P)是与化合物在不同有机溶剂中的溶解性相关的一个重要参数。分配系数(P)是指某种化合物在两种不混溶溶剂(通常是水和正辛醇)的混合物中溶解达到平衡状态时，浓度的比率(图26)。该系数是衡量化合物在两种溶剂中不同溶解性的量度。分配系数可以衡量化合物的亲水或疏水程度。

就CC而言，分配系数有助于确定目标化合物是否适合采用ACQUITY UPC2系统进行分析。一般情况下，如果化合物的log P介于-2和9之间，就可以使用CC进行分析。

合相色谱中的助溶剂

助溶剂有两个作用。第一，它会影响CO2的溶解能力。第二，它会影响分析物与固定相之间的相互作用。改变助溶剂(例如，从甲醇更改为乙腈)会影响分析的保留性和选择性。助溶剂在CC中的作用类似于强溶剂在反相LC中的作用；CO2本身的洗脱强度大致接近庚烷。

第一章中的表1列出了一系列有机溶剂的洗脱序列(洗脱强度)，并重点介绍了CC中最常用的四种助溶剂：乙腈、异丙醇、乙醇和甲醇。所列溶剂均能与CO2混溶，得到保留性和洗脱强度各不相同的一系列流动相。

图27：改变助溶剂浓度对等度分离的影响

图28：在梯度分离中改变助溶剂类型所产生的影响

图29：在梯度分离中使用混合助溶剂所产生的影响

添加到CO2流动相中的助溶剂通常可缩短分析物的保留时间。助溶剂浓度升高时，流动相的极性会发生变化，从而缩短保留时间。图27展示了等度分离中助溶剂浓度的改变对分析物保留性的影响。随着强洗脱助溶剂(甲醇)浓度的降低，分析物的保留时间延长。这与RPLC中观察到的现象相同。

图28所示为使用不同助溶剂时流动相强度的变化情况。甲醇是最强的助溶剂，洗脱分析物的速度最快。异丙醇比甲醇弱，但比乙腈强，在CC分析中，乙腈是三种助溶剂中最弱的，它保留分析物的时间最长。其它模式的色谱分析中也会发生类似的色谱现象 - 溶剂越强，保留时间越短，分析物洗脱越快。

CC分析可采用混合助溶剂，用以改变溶剂强度和保留性。图29展示了对甲氧氯普胺及其相关杂质进行梯度分离时，向甲醇中加入弱助溶剂(乙腈)所产生的影响。随着乙腈浓度升高，甲醇浓度降低，溶剂强度随之变弱，使得保留时间变长。在本例中，采用不同助溶剂执行分离时，选择性发生了微弱变化，分离度得到改善，峰形也变得更加尖锐。

合相色谱中的添加剂

与RPLC一样，在CC分析中，添加剂可改善分离的峰形和/或分离度。图29所示的四张色谱图展示了在所有的混合助溶剂中加入甲酸铵的影响。添加剂可对固定相表面进行改性，或是充当离子对，进而改变选择性。碱性添加剂能够改善碱性化合物的峰形，还能轻微改变选择性。碱性添加剂的例子包括氢氧化铵、异丙胺和三乙胺。酸性添加剂能够改善酸性化合物的峰形，还可能改变选择性。常用的酸性添加剂包括三氟乙酸、甲酸和乙酸。图30例举了一种酸性分析物的分离结果，在该例中，随着酸性添加剂的浓度升高，峰形得到了改善。

图30：在CC分析中改变添加剂浓度对峰形的影响

图31：在CC分析中使用不同类型的添加剂对碱性化合物峰形的影响

换用不同的添加剂会显著影响峰形和保留性(图31)。在分析这类碱性分析物(β-受体阻滞剂)时，使用不含添加剂的甲醇助溶剂得到峰形很差。添加甲酸实际上会使峰形变差。甲酸还会在220 nm检测波长处发生吸收，使基线倾斜。对于这些强碱来说，加入醋酸铵(20mM)能显著改善峰形，加入二乙胺也有相同的作用，因为碱性添加剂通常都能改善碱性化合物的峰形。

合相色谱中的样品稀释剂

尽管CC兼容多种样品稀释剂，为了获得理想峰形，选择合适的稀释剂有时仍然是很有必要的。在CC分析中，样品稀释剂的强度可显著影响峰形和溶解性。和其它模式的色谱一样，我们建议使用尽可能弱的样品稀释剂，以便平衡分析物溶解性和峰形。对于CC分析，这意味着必须使用靠近洗脱序列(表1)前端的有机溶剂来溶解样品。沃特世推荐以庚烷/异丙醇(90:10)作为通用溶剂，它能很好地平衡溶解性(异丙醇)和峰形(庚烷)。必须降低样品中的水含量，如果可能的话最好将水去除。图32所示为中性化合物对羟基苯甲酸丁酯的7张谱峰叠加色谱图。随着进样体积增加，进样溶剂强度对峰形的影响逐渐显现出来。使用强助溶剂甲醇时，随着进样体积增加，出现了伸舌峰。与甲醇相比，使用极性较弱的助溶剂异丙醇时峰更高，且伸舌峰不明显。而使用推荐的样品稀释剂异丙醇/正己烷时，所有进样体积都能获得尖锐、对称的峰形。

图32：在CC分析中改变样品稀释剂强度对峰形的影响。沃特世推荐的混合比例是90:10，但本例中采用的比例是70:30。

压力、温度和密度

自动背压调节器(ABPR)通过改变压缩CO2的密度来影响保留时间。随着ABPR的设置压力升高，CO2密度会变大，从而使保留时间缩短。尽管流动相组成对分离的影响最大，但通过压力调节来改变流动相密度也能对方法进行微调。如图33所示，在保持所有其它参数不变的情况下，提高APBR设置(压力)可缩短保留时间。

图33：压力(密度)对保留性的影响。常用的ABPR操作压力范围为1500–2200 psi (100–150 bar)。

与RPLC一样，在CC分析中，柱温会同时影响选择性和保留性，而且不同分析物受影响的程度各不相同。升高柱温会增大分析物分子的能量，与LC或GC分析类似，这会导致分析物在固定相上的保留时间缩短。但对于CC分析，在恒压下升高温度又会降低流动相密度，从而削弱其溶解能力，进而延长保留时间。因此对于CC而言，温度变化具有双向作用。通常情况下，随着柱温升高，流动相密度会降低，使得保留时间延长(图34)。另外我们还注意到，在50 ℃下分析时出现了一个额外的(小)峰。这是细微选择性差异导致的结果，因为温度对不同分析物的影响方式各不相同。

图34：柱温(密度)对CC保留性及选择性的影响

在了解助溶剂、添加剂、样品稀释剂、压力、温度以及固定相在CC分析中发挥的作用之后，我们可以通过改变这些参数来改善峰形、保留性以及选择性。表5汇总了本章的所有内容，展示了如何使用这些工具来优化CC分离。不过需要注意的是，对于特定的分离，各个参数的重要性可能不尽相同。例如，在调节选择性时，固定相的作用有可能比助溶剂更大。在某些情况下，将甲醇助溶剂更换为50:50甲醇/乙腈比更换色谱柱填料的作用更明显。

表5：优化CC分离

通用方法开发方案 — 方案1

图35展示了一套用于快速确认样品是否可溶于CC兼容进样溶剂的方案。如果分析物的log P值介于-2和9之间，那么该分析物就能溶于与CC兼容的进样溶剂。如果其log P值小于-2，则分析物只能溶于水性溶剂，因此可能不适合采用CC分析。如果分析物的log P值未知，则必须在进样前将该分析物溶于合适的有机溶剂中。请注意，合相色谱更类似于正相色谱，即对于CC而言，甲醇是非常强的溶剂(这一点与反相LC相反，在反相LC中甲醇是相当弱的溶剂)。

因此，需使用庚烷/异丙醇等较弱的溶剂来溶解(或稀释)样品。分析人员需要在样品溶解性和峰形之间找到平衡点，具体可参阅本章前面部分所讨论的“样品稀释剂对CC峰形的影响”。

图35：确认目标分析物是否可使用CC进行分析的方案

除了选择样品稀释剂外，在开发方法时还需要考虑其它问题。例如，怎样的色谱条件更适用于分析目标分析物？图36所示为一系列推荐的通用起始条件，已知采用该方案可保留和分离多种分析物。与任何其它模式的色谱一样，这些条件并非适用于所有情况，分析人员可应用一定的策略来改善峰形、改变选择性和保留性。

图36：CC方法开发的推荐起始条件

针对上述情况，图37、38和39给出了改善峰形、改变保留性和选择性的系统化方案，这些方案与反相LC中所用的方案并无明显差异。图37所示为改善峰形的方案。该方案的起始点是基于目标分析物酸碱基本属性的一组推荐条件。通常酸性化合物在酸性条件下峰形更好，而碱性化合物在碱性条件下峰形更好。改善峰形的策略包括尝试不同的添加剂、改变添加剂浓度以及改变色谱柱填料。

图37：改善CC峰形的策略

图38：改善CC保留性的策略

图39：改变CC选择性的策略

图38所示为改善保留性的方案。与任何其它形式的液相色谱一样，换用其它(更弱的)助溶剂是理想方法。在CC分析中，甲醇是最强的助溶剂，使用乙腈或其它醇类等较弱的助溶剂可以延长分析物在色谱柱上的保留时间。展平或降低梯度斜率(降低助溶剂的最终百分比或延长梯度持续时间)也是有效的方法。使用混合助溶剂，降低甲醇浓度可削弱助溶剂的整体强度，从而延长保留时间。能够调节色谱柱中流动相的密度是SFC和CC的特有属性。通过调节流动相密度可以改变整体保留性，因为密度越低，保留时间越长。降低ABPR压力设置和/或升高温度可达到该目的。最后，换用其它色谱柱填料也是延长保留时间的策略之一。

图39所示为改变分离选择性(洗脱顺序、相对保留性)的方案。尝试用其它助溶剂(如乙腈)取代甲醇是方法之一。将醇基质子助溶剂换成非醇基非质子助溶剂(如乙腈)对选择性的影响远远大于将甲醇换成其它醇类。由于降低甲醇浓度会削弱助溶剂的整体强度，因此这种方法可延长保留时间并改变选择性。调节流动相的密度还可改变分析物的整体保留性，由于不同分析物受流动相密度变化的影响各不相同，保留性的变化也许足以优化特定分析物的分离。最后，该方案还建议尝试不同的色谱柱填料(如果需要)。

色谱柱系列方法开发策略方案 — 方案2

上一节中介绍的方法开发方案侧重于通用起始条件以及如何通过改变流动相属性来微调分离性能。本节将介绍另外两种替代方案 — 一种方案用于手性分离，另一种则用于非手性分离。这两种替代方案都需要将两个方面相结合，第一是色谱柱，第二是从统计学角度来看，能够大幅提高分析各类测试化合物成功率的方法。一般而言，CC色谱柱选择都应用“简单匹配”原则 - 但本节中提出的方案建议采用分步策略。

使用UPC² Trefoil色谱柱进行手性分离的方法开发策略

我们推荐的手性化合物分离方法筛选方案采用三种Waters UPC² Trefoil手性填料 - AMY1、CEL1和CEL2。图40所示的筛选方案建议使用包括四个步骤、四根色谱柱的理想流路筛选方案以及经过优化的混合助溶剂，以尽可能地提高成功几率。

根据该方案，首先应使用含20 mM醋酸铵的乙醇:异丙醇:乙腈(1:1:1)混合溶液和AMY1色谱柱开始筛选。如果该方法不能达到所需分离效果，接下来的方法应采用CEL1色谱柱和含有0.2% TFA的甲醇:异丙醇(1:1)混合溶液 - 后续筛选步骤以此类推。图40右侧给出了详细的方法条件。

图40：为成功的手性分析筛选手性色谱柱和分析方法的策略

使用UPC² Torus色谱柱进行非手性分离的方法开发策略

非手性分离方法的筛选方案都比较类似。具体可按照下述三大步骤执行。

步骤1

首先使用Torus 2-PIC (3.0 x 100 mm)色谱柱及下列色谱条件执行快速探索步骤：1.2 mL/min，甲醇在3 min内从4%增加到50%，30 ˚C，2000 psi BPR。考察所得结果：

a) 是否满足选择性和峰形要求，然后根据需要进一步优化方法。

b) 是否存在“选择性良好，但峰形有待改善”的情况，如果是，加入添加剂(分析酸时添加甲酸，分析碱时添加碱性添加剂)之后在Torus 2-PIC色谱柱上重新运行分析。

c) 如果数据显示有必要改变选择性，则继续进行步骤2。

步骤2

根据样品性质，选择从探索筛选流程中选出的理想路径。然后继续使用该流程，采用推荐的色谱柱和助溶剂组合继续优化方法，直到实现所需的分离效果。

步骤3
为了对分离进行微调，可通过调节方法的助溶剂组分、温度、添加剂和压力来优化分离。第4.7节中的图示展示了如何通过这种方式来优化方法。

图41：为成功的非手性分析筛选色谱柱和分析方法的策略