方法放大
若初步证明某分离物具有潜在价值，可“放大”分离方法，分离出更大量的该分离物以供进一步评估。要在大规模分离中维持小规模分离的各项属性（如分离度等）很容易。必须借助已定义的数学公式修改流速、上样量和系统硬件参数，从而有效地将分离方法
转移至更高容量的色谱柱。
方法放大的第一阶段通常是获取mg级到g级的分离物用于从早期生物学评价到建立具有改进治疗特性的产品类似物的结构 - 活性关系等多种用途。方法放大的下一阶段需要获取100 g到数千克（或更多）的目标物质用于临床前和临床开发，如果开发成功，将最终决定全面投产。这种规模的分离要用到良好生产规范(cGMP)等指导文件和质量控制手段¹。
表3：色谱规模、目标物质量和相关应用。
方法放大工作流程分为几个步骤。必须保证放大计算的准确性，否则最终可能无法达到小规模分离的分离度。为了提高方法放大的成功率，同时维持保留时间和选择性不变，需要仔细考虑以下要求：
- 小规模和大规模分离必须使用相同的流动相。
- 使用填料、柱长和粒径相同的色谱柱非常容易进行方法放大（或者在保持初始方法的柱长-粒径比率(L/dp)不变的前提下改变粒径）。
- 应使用相同的稀释溶剂制备浓度相同的样品。
图18：方法放大工作流程。
确定延迟体积
在放大方法或更改系统时，延迟体积（即系统体积或死体积）对于维持早洗脱峰的峰分离度很重要。延迟体积是指梯度形成处到色谱柱柱头之间的体积。在高压混合LC系统中，该体积主要包括混合器、连接管路和自动进样器定量环的体积。低压混合系统包括来自泵的上游溶剂，因此这些额外的管路体积加上泵头（一个或多个）体积，再加上混合器、连接管路和自动进样器定量环的体积共同组成了总延迟体积。
图19：导致延迟体积的纯化流路组件（用虚线圈出）。
等度分离的流动相组分通过在线方式混合，这种情况下仍然存在延迟体积，但由于流动相浓度恒定，色谱分离结果中观察不到差异。另一方面，梯度方法则依赖流动相浓度随时间的变化实现峰分离。在梯度方法中补偿延迟体积可确保峰保留时间得以维持，需要收集纯馏分时，这一点尤为重要。
如需测定延迟体积，可根据www.waters.com/prepcalculator 上的“分析级至制备级梯度转换器”所用的方法，采用流动相A和含有UV吸收能力不同的添加剂（例如0.05 mg/mL尿嘧啶或0.2％丙酮的乙腈溶液）的流动相B溶剂组成分级梯度进行测定。
表4：确定延迟体积的步骤。
图20：用于测定分析型系统和制备型系统的系统体积的分级梯度。
色谱柱容量
在纯化色谱分离中，保持目标化合物具有足够的分离度是一个关注重点。色谱柱容量（或称上样量）以化合物与邻近峰的分离度为衡量标准。虽然色谱柱容量主要受色谱柱柱长和内径影响，样品溶解性和样品混合物的复杂性等其它因素对此也有一定影响。色谱柱容量的趋势如下：
- 色谱柱容量主要取决于具体样品的溶解性。
- 简单混合物的色谱柱容量更高。
- 如果需要较高的分离度，应降低色谱柱容量。
- 色谱柱容量在很大程度上取决于上样条件。
表5：常用制备型色谱柱规格的估计上样量(mg)。
示例：以4.6 x 50 mm的色谱柱为例，其预计上样量为每20 μL进样对应3 mg。
在方法放大之前，应通过上样量研究来确定特定目标化合物的理想上样量。这些研究以小规模进行，并采用以下其中一种方法：制备高浓度样品，然后逐步增大进样体积；或者制备多个浓度的样品，进样体积保持恒定。这两种方法的目标都是在保持目标化合物与邻近杂质之间具有足够分离度的前提下，确定可进样的最大样品浓度或进样体积。确定色谱柱容量后，可利用公式将其放大，以便用于内径更大的色谱柱和大规模工作流程。
图21：上样量研究。可以看到星号标注的峰的分离度随上样量增大而降低。
公式10：上样浓度放大
因此，要将4.6 mm x 50 mm分析型色谱上1800 μg (1.8 mg)的上样量等效放大至19 mm x 50 mm制备型色谱柱：
公式11：进样体积放大
要放大20 μL的进样体积：
柱头稀释
DMSO等强溶剂可以改善样品溶解性，进而可能增大色谱柱容量。然而，进样大体积的强溶剂会导致色谱峰畸变，这反而会减少可成功分离的产物量。若强溶剂从进样器输送到柱头的过程中在水性溶剂流中间形成溶剂簇，就会导致峰畸变。溶剂簇边缘的强样品溶剂被水性溶剂稀释，可能会引起样品沉淀，这种沉淀可能会堵塞流路塞，进而导致高压系统关闭。
图22：流动相在色谱柱内稀释样品簇。如果使用强稀释剂制备样品，则样品簇在流经含有水性流动相的色谱柱时，样品簇边缘可能会产生沉淀。
如果沉淀没有导致系统关闭，样品将进入色谱柱，但色谱柱上不会有样品被保留，直到样品簇被流动相稀释。进样体积较大时，样品簇必须沿着色谱柱移动相当长的一段距离才能达到所需的稀释度。在这种情况下，样品沉积为宽谱带，占据大部分色谱柱体积，这会导致需要大量洗脱液才能洗脱出很宽的峰，且峰分离度不足。通过严格限制进样体积和上样量可以避免这种情况。替代方法是用水或弱溶剂对样品进行充分稀释，以确保足够的保留性能。
图23：将样品溶于强溶剂中进样的传统进样方法。样品簇在沿着色谱柱移动的过程中被稀释，会导致峰畸变。
由于通量和回收率受到影响，上述两种方法都不理想。柱头稀释系统采用另一种配置，能够在色谱柱入口处使用水性稀释剂流对输送至此的样品簇进行连续稀释。输送至色谱柱的流速非常快，因此不会产生沉淀。接下来，样品分子会被吸附到填料上，形成非常窄的谱带，进而被洗脱为分离良好的小体积峰。柱头稀释还使得样品不容易在定量环或柱头处发生沉淀，因此能改善系统稳定性。由于样品组分峰之间的分离度得以改善，我们可以增大进样量，从而减少分离所需的进样次数。在实际操作中，采用柱头稀释通常可将色谱柱上样量提升3~5倍。发生高压关闭的频率降低，色谱柱寿命也更长。
图24：柱头稀释系统。样品簇被输送到色谱柱入口，并在此经水性稀释剂流连续稀释，因而不会产生沉淀。样品谱带可洗脱为具有理想分离度的小体积峰⁶。
图25：采用传统进样方法和柱头稀释法进样溶于强溶剂的样品结果对比。柱上进样量为1000 μL（相当于133 mg）³。
流速放大
为了在放大过程中保障分离质量，小规模和大规模色谱柱的线性流速必须保持恒定，因此在柱长、粒径和填料相同的大规模和小规模色谱柱之间进行流速放大效果十分理想。放大流速时必须考虑系统的硬件能力，例如最大泵流量和背压限制。如果硬件无法满足流速要求，应考虑更换合适的仪器以满足放大要求。
公式12：流速放大
例如，假设分析型色谱柱(5 μm, 4.6 mm x 50 mm)的流速为1.5 mL/min，则制备型色谱柱(5 μm, 19 mm x 50 mm)的流速通过以下公式计算：
梯度持续时间放大
一般来说，如果可通过调节流速保持流动相线性速度不变，进行方法放大时不需要更改梯度。如果柱长不同，则必须计算梯度时间，以保持小规模分离时的分离度和保留时间。
公式13：梯度时间放大
例如，50 mm分析型色谱柱上持续5 min的线性梯度区段在100 mm制备型色谱柱上应为10 min：
制备转换器
上样量、流速和梯度的放大计算也可以通过制备型OBD方法转换器执行。该转换器是一款操作简单的应用程序，可执行所有分析级到制备级的放大计算，包括上样量、系统体积、流速、溶剂体积消耗量、质谱引导的色谱分离方法的分流比计算，以及梯度聚焦UPLC方法到制备级方法的转换等。您可以通过www.waters.com/prepcalculator 或沃特世纯化软件（如ChromScope™）访问该应用程序。
图26：沃特世制备型OBD方法转换器，可通过www.waters.com/prepcalculator 上的Web Toolbox（网络工具箱）访问。
图27：沃特世分析级至制备级梯度转换器根据分析级分离条件确定制备级分离条件。
