进样

通量较低时可以手动进样，在高通量应用中则可以选择自动进样。执行手动进样时，首先通过旋转阀手柄从流路中移除装有进样定量环的Rheodyne阀。接下来将过滤后的样品吸入注射器中，连接钝针头并除去气泡。将针插入进样口，然后将样品注入进样定量环中。旋转Rheodyne阀手柄，将进样定量环装回流路中。样品将从该位置进入流路。

图33：手动Rheodyne进样阀组件。

高通量应用也可执行自动进样。大容量自动进样器可通过单个平台管理样品抽吸和进样。纯化软件中配置有机械臂，用于控制微孔板、试管、闪烁瓶或常规自动进样器小瓶的进样。

进样定量环

实验中通常根据预期的进样体积来选择进样定量环。如果定量环体积过大，样品可能吸附到定量环多余的表面上，引起延迟，或者导致样品扩散，这两种情况都对色谱质量有不利影响。使用尺寸接近预期进样体积的定量环可获得理想重现性和色谱图。

馏分收集器

应用的预期通量决定了馏分收集操作所需的自动化水平。馏分收集器由开关和样品分流阀组成。分流阀会适时打开，在化合物洗脱时进行收集。在低通量应用中可以手动收集馏分，在高通量应用中则可以执行自动馏分收集。自动化水平取决于目标馏分的数量和体积。高通量馏分收集器通常会配备安装有进样和馏分收集探头的机械臂，将进样和馏分收集功能集成到同一工作台上。

图34：配备通风橱（可选）的Waters 2767样品管理器和馏分收集器。

收集容器

许多纯化系统都可使用各种形状、尺寸和容积的收集容器。最常用的收集容器包括试管、样品瓶、收集瓶或者可将收集物注入大型容器的漏斗等。接触样品和溶剂的收集容器必须洁净、干燥且为惰性。收集容器一般敞口放置在容器收集床上，等待注入分离物。某些收集系统不会将未收集的馏分导入普通废液，而是可将其导入专为特定样品设置的废液容器。如果用户收集的峰不正确、运行的方法不合适、未检测到目标物质或没有触发收集，则馏分将流入特定的废液容器，用户可蒸发去除其中的溶剂，然后重新溶解样品并重新进样。

检测器

执行纯化色谱分离时，应特别注意检测环节。纯化常用的四种检测器分别为：紫外可见光(UV/Vis)检测器、示差折光(RI)检测器、蒸发光散射(ELS)检测器和质谱(MS)检测器。检测器既可在用户设定的单波长下执行检测(UV/Vis)，也可以采集样品在特定波长范围内的吸光度（光电二极管阵列(PDA)检测器）。PDA通常在方法开发阶段用于为目标化合物选择合适的检测波长。采用可见光范围内的波长进行检测时，通过采集200~400 nm或更高(≥ 350 nm)的信号来筛选波长。目标化合物信号强度最高时的波长即为进行分离的最佳波长。此外，还需确定检测邻近洗脱杂质的最佳波长。否则，在某个波长下收集的“纯分离物”以不同波长检测时，实际上可能含有杂质。如果发生这种情况，可能需要再次进行方法开发和纯化，进一步纯化分离物。

使用紫外可见光检测器和PDA检测器时，其高灵敏度特征可能会对纯化中常见的大进样体积和高浓度样品检测产生不利影响。因此，应选用短光程(1~3 mm)检测器流通池，而不使用长光程(10 mm)分析流通池。

图35：2998光电二极管阵列(PDA)检测器。

RI检测器在检测紫外吸收能力有限或无紫外吸收能力的组分（如醇类、糖类、脂肪酸和聚合物）方面有一定优势。它通过检测折射率差异来确定化合物存在与否。RI检测器有时又被称为“通用”检测器，因为它不要求化合物电离或含有发色团。但是，RI检测器会检测梯度干扰，进而导致基线漂移，因此只能用于等度分离，这是它的一个缺点。

图36：Waters 2414示差折光(RI)检测器。

ELS检测器可用作紫外可见光检测器和RI检测器的替代检测器。ELS检测器的工作原理如下：洗脱液流经加热的喷雾器，使得分析物挥发并使溶剂蒸发；溶剂作为气体被带走，而分析物形成的微粒流将穿过光源和检测器并发生光散射，由检测器检测散射光。ELS检测器的主要优点是能够检测不含发色团的化合物，而且等度和梯度分离均适用。但是，ELS检测器对样品有破坏性，因此不能设置在主流路管路上，必须进行分流，将小部分液流导向至ELS检测器，剩余部分则进入馏分收集器。

图37：Waters 2424蒸发光散射(ELS)检测器。

MS检测器将对色谱柱中洗脱出的样品化合物进行质谱分析，基于质量数对其进行鉴定。MS分析是灵敏度和选择性非常高的分子分析方法之一，可获取分析物分子的分子量和碎裂模式信息，对于分析物确证而言极有价值。市面上有配备不同类型接口的各种MS系统，最常用的是电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)接口。每种接口的适用性、流速范围、灵敏度和响应线性各不相同。和ELS检测器一样，MS也是一种破坏性技术，因此必须分流，只让小部分液流进入检测器，主要部分导入馏分收集器。

图38：Waters ACQUITY QDa质谱检测器。

分流器

使用化学破坏性检测器时（如MS或ELS），必须从来自色谱柱的主液流中分流出一部分导入检测器用于触发馏分收集。由于检测器必须在馏分收集器被触发之前检出峰（延迟时间），因此分流的液流必须在主液流到达馏分收集器之前到达检测器。为此，我们使用“补偿泵”和“补偿溶剂”来提升分流流速。

分流器包括“被动”分流器和“主动”分流器。被动和主动分流器在主样品流采样方面的性能相当，因此具体采用哪种类型的分流器取决于用户偏好。

被动分流器采用限制性管路（例如延迟盘管和“T型接头”）来维持特定流速范围和分流比。

图39：被动分流器盒。

图40：被动分流盒的液流示意图。

表6：沃特世被动分流器。

主动分流器具有两条完全分开的流路和一个快速切换阀，该阀会将主液流的一部分转移至补偿液流，在此以设定的分流比对液流进行稀释。

管路

在为流路确定适用的管路时，必须考虑以下因素。首先，系统流路管路的完整性很大程度上取决于管路材料的适用性以及具体应用。管路可由PEEK（聚醚醚酮）高性能工程聚合物材料或不锈钢制成，并且应与样品和流动相化学相容，以防止样品粘附到管路表面，造成样品损失、残留或影响产量。

此外，系统管路应能够承受流路的压力和操作温度，尽管纯化色谱通常不会对流路进行温度控制，温度问题并不是很重要。

考虑压力限制时，色谱纯化系统可分为三个区域 - 溶剂容器与泵之间的“低压”区；泵与色谱柱入口之间的“高压”区；以及位于检测器之后，色谱柱出口与废液容器或馏分收集器之间的第二个“低压”区。每个区域对管路的耐压要求各不相同。如果在耐压要求非常严格的压力区域内使用材料不合适的管路，不仅会影响分离性能和导致色谱问题，还有可能致使管路渗漏和破裂。

用户必须考虑两个可变因素：管路内径和长度。一般来说，管路内径越小，其内部流速越快，样品扩散程度就越低，可使样品尽可能保持集中。但是，随着管路内径减小，管路产生的压力会显著增大，这可能会导致系统背压升高，无法与检测器流通池或其它系统组件兼容。不同内径的管路相连时，接头处或其附近可能会形成死体积。若液流或流动相不能充分流过死体积区域，就会造成峰形问题和残留。

对于管路长度，其产生的流路体积越大，样品越容易被流动相稀释，分离的组分也越容易重新合并。管路长度还与系统压力、延迟体积和柱外体积有关。为了避免以上问题，应在不影响功能的前提下尽量缩短管路长度。

大规模制备型纯化系统通常以高流速运行，为了降低高流速引起的高背压，需要在纯化系统中连接内径合适的管路，以确保高质量的色谱结果。您可以选择一系列内径不同的管路，适用流速范围为0.05 mL/min~130 mL/min。